转录组（Transcriptome）是指特定细胞或组织中一起转录居品，包括信使RNA，核糖体RNA、转运RNA以及非编码RNA。转录组学（Transcriptomics）是使用高通量测序时刻，全面快速获取某一物种特定组织或器官在某一景色下RNA序列信息，并对其结构和抒发信息进行分析。

转录组测序（RNA-seq）便是愚弄高通量测序时刻将细胞或组织中一起或部分mRNA、small RNA和no-codingRNA进行测序分析的时刻。RNA-seq既不错提供定量分析，检测基因抒发水平各异，又不错提供结构分析，能发现稀奇转录本，精准地识别可变剪切位点、基因交融等，况兼不依赖于参考基因组。

当今，转录组测序已经是开展分子生物学征询、基因功能征询、分子机制征询中不成或缺的一种时刻技巧。在进行转录组测序之后，时常需要对分析效果中感兴趣的本色进行生物学考证。转录组测序有关的征询可从基因/转录本抒发、结构分析和RNA修饰等多个维度启航，因而不错基于此，从抒发、序列或功能等方面形成完满的考证履行想路。围绕这个想路，以下提供了最为全面的转录组测序下贱履行考证门径。

伸开剩余90%一、抒发定量考证

1. 荧光定量PCR（qRT-PCR）考证基因简略转录本抒发情况

通过荧光定量PCR考证基因抒发水平，基于内参基因（管家基因：保管细胞基因代谢举止所必需的基因，在各组织和细胞中抒发相对镇静）的抒发水平，赢得方针基因的相对定量水平，常见的内参基因包含GAPDH、β-Actin、18S rRNA等。

注：因qRT-PCR与转录组测序定量旨趣不同，一般提倡关心基因抒发趋势是否一致。

（Zhou B, et al. Eur. J. Immunol.2023）

2. Western Blot考证卵白抒发情况

通过Western Blot（免疫思绪法）考证各异基因是否在翻译水平发生变化，应用特异性抗体，标记卵白水平变化。其旨趣是愚弄卵白质所带分子量不同，在凝胶电泳中产生不同的电泳速率而被分离。分离后的卵白质被和谐到PVDF 膜或 NC 膜上，以固相中的卵白质或多肽看成抗原，与对应的抗体起免疫响应，再与酶或同位素标记的第二抗体起响应，经过底物显色或辐射自显影以检测电泳分离的特异性成见基因抒发的卵白身分。常见的抗体类型包括兔抗、羊抗、鼠抗等。

注：征询标明，卵白质与转录水平的有关性较弱，因此提倡在征询功能层面时，进行卵白质层面的考证。

（Pierattini B, et al. Mol Ther-Nucl Acids.2023）

3. Northern blot考证RNA含量

通过Northern blot考证RNA的抒发情况，且对成见片断大小检测有较高的颖慧度：Northern Blot 选拔琼脂糖凝胶电泳，凭证分子量大小不同将不同的RNA分离开来，然后将其原位和谐至固相支撑物（如尼龙膜、纤维膜等）上，再用标记过的DNA或RNA探针，依据碱基互补配对的原则进行杂交，随后进行显影或显色，以检测方针RNA场地位置，其显影强度则可教学方针RNA在所测样品中的相对含量。

（Kurihara Y, et al. Commun Biol. 2023）

二、序列定性考证

1. RT-PCR考证可变剪切

通过RT-PCR考证可变剪切，其旨趣是在剪切事件发生区域策画特异性引物以扩增特定片断，通过电泳分离居品并不雅察条带大小各异，从而考证是否存在不同的剪切体式。款式为凭证IGV浏览器详情发生的事件及对应区域的序列，在序列区域隔壁策画特定引物，进行PCR扩增，详情片断长度。

（Zhang H, et al. Physiol Plantarum.2023）

2. RACE考证Poly(A)

3' RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）是征询mRNA 3’结尾的常用技巧，因为mRNA可能具有多个3’结尾 PAC区域，因此可凭证该特质策画履行进行Poly(A)考证。区别于鲁莽的RT-PCR，3' RACE考证需要扩增出mRNA 3’结尾的扫数条带，所使用的引物相对比拟特别，正向引物选取在近端Poly(A)的左侧区域，而反向引物则选取在 Poly(A)位点上，对应cDNA上Poly(T)引物区域，响应圭臬和所用的响应体系不错按照RT-PCR来。

（Mukherjee S, et al. Front Immunol.2023）

3. RNA荧光原位杂交（RNA-FISH）考证RNA定位

RNA-FISH（RNA荧光原位杂交）愚弄荧光标记的核酸探针与细胞内靶RNA分子进行特异性杂交，从而竣事对RNA分子在细胞内原位定位的征询。其旨趣基于碱基配对原则，通过策画与方针RNA序列互补的探针，在细胞经过固定、透化解决后，让探针插足细胞并与RNA聚合，通过荧皎皎微镜不雅察到的荧光信号可精证实识RNA在细胞内的散播情况。

（Mamontova V, et al. bioRxiv. 2024）

三、RNA修饰考证

1. 黑点杂交（Dot blot）

黑点杂交（Dot blot）可检测和坚决 DNA、RNA 和卵白质，通过显影黑点的有无及表情的浅深来判断是否有杂交偏抓杂交强度。在征询 RNA 修饰时，黑点杂交常用于对细胞内总RNA的修饰水平进行定性或半定量分析。具躯壳式是：将待测的 RNA 变性后点加在硝酸纤维素膜或 NC 膜上，紫酬酢联固定后，用m6A简略m5C抗体进行杂交，洗膜，辐射自显影，以黑点有无或表情的浅深代表RNA修饰水平的上下。

（Sun B, et al. Plos Genet. 2022）

2. 质谱检测法（HPLC/LC-MS）

HPLC选拔串联质谱的款式，通过聚合酶解决和离子打碎，将核酸打断成核苷和碱基，凭证出峰保留期间和峰面积，计较m6A和总腺嘌呤的比例，得到mRNA的合座m6A甲基化进程。然则，此种门径无法明确发生修饰的具体RNA以及修饰的具体位置。

（Liu C, et al. Nat Biotechnol. 2022）

3. MeRIP-qPCR

用以对方针基因上的某个修饰位点（以一小段区域的体式，MeRIP法精准不到单碱基）的修饰水平进行考证。其旨趣同MeRIP-seq测序中MeRIP履行疏浚，履行基本操作也一致：对RNA进行片断化，然后将片断化后的RNA样品分为二部分：一部分用于免疫共千里淀履行（IP）后看成IP样品，另一部分不进行IP径直看成Input样品。之后再凭证履行成见的不同，对两部分RNA片断进行逆转录和qPCR。

（Price A M, et al. Nat Commun. 2020）

4. MeRIP-seq

meRIP-seq是参考Chip-seq发展出来的一种坚决RNA修饰的门径，当今meRIP-seq已见效应用于m6A和m5C的检测。其旨趣和款式为：率先通过polyA拿获mRNA，简略通过rRNA剔除时刻去掉rRNA，然后将赢得的RNA打成100nt傍边的小片断；之后使用修饰特异性的抗体（m6A或m5C抗体）进行免疫共千里淀，含有修饰的RNA片断被富集并回收；进而对回收的RNA进行文库构建、高通量测序和生物信息学分析，通过peak分析坚决出RNA修饰的区域。

四、基因功能考证

1. 基因敲除

基因敲除是通过不同政策竣事方针基因功能丧失以深切谈判其生物学作用的关节时刻。主要包括插入突变、RNA干豫和CRISPR/Cas9基因剪辑三种门径。其中RNA干豫是通过策画与内源mRNA同源的dsRNA，经Dicer酶加工成siRNA，形成RISC复合物切割靶mRNA，扼制基因抒发；CRISPR/Cas9系统愚弄sgRNA携带Cas9卵白在基因组精准位置切割DNA，通过NHEJ斥地机制形成基因功能丧失。

2. 基因过抒发

基因过抒发是通过将方针基因编码区序列CDS构建到质粒或病毒等载体上，愚弄载体上的调控元件竣事基因在东谈主为死心条目下的大批转录和翻译。这还是过有两种主要政策：瞬时转染和镇静转染。瞬时转染是将外源基因载入细胞但并不整合到染色体中，能在短期内获取高水平的基因抒发居品，适用于快速制备极少至中量的重组卵白；镇静转染则是将成见基因整合到宿主细胞染色体中，形成镇静抒发且不错遗传给后代的细胞株。

五、分子互作考证

1. 双荧光素酶检进修证RNA与RNA互作

双荧光素酶检测可用于考证RNA与RNA互作。其基应允趣是将待测RNA片断远隔与两种酶讲述基因构建交融抒发载体，各自产生不同类型的荧光信号。履行中，当两种含有所征询RNA片断的交融卵白在细胞内抒发时，若这两种RNA之间存在互作，则会蜕变各自的构象或镇静性，进而影响各自所相连的荧光素酶活性。通过检测荧光信号强度的变化，即可判断RNA间是否存在互相作用。

2. RNA pull-down考证RNA与卵白互作

RNA pull-down是通过特定的RNA分子（时常是已知的非编码RNA或mRNA的片断）来富集与之互相作用的卵白质，以便进一步征询RNA与卵白的互作。该履行是在已知成见RNA存不才，谈判与其聚合的卵白。RNA pull-down是使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞浆卵白索求液共同孵育，形成RNA-卵白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠聚合，从而与孵育液中的其他身分分离。再愚弄游离生物素竞争洗脱复合物，通过Western Blot履行检测特定的RNA聚合卵白是否与RNA互相作用，简略聚合质谱（Mass Spectrometry）筛选RNA聚合的未知卵白。

3. 酵母双杂交考证卵白与卵白互作

酵母双杂交时刻是一种愚弄活体酵母细胞来检测和考证两个方针卵白质之间是否存在互相作用的门径。其基应允趣是将待测卵白A与酵母转录因子的激活扣构域交融抒发，同期将卵白B与转录因子的DNA聚合结构域交融抒发。当卵白A和卵白B在酵母细胞内发生互相作用时，会重新拼装成一个完满的功能性转录因子，进而激活特定讲述基因的抒发。履行款式主要包括构建交融卵白抒发载体、转入酵母细胞、筛选阳性克隆以及讲述基因活性检测。通过不雅察酵母细胞的滋长情况及讲述基因抒发水平，即可判断两种卵白质间是否存在互相作用。（起原：贝纳科技）

发布于：江苏省